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请教怎样看纸层析苹果酸测定图
这是我的第五个“作品”了。
第一次由于我的电脑发不了图，耽搁时间太长，图淡化而不能用了。
第二次用左面第一个瓶，由于广口瓶不够高，纸高度也不够，只用了四个小时展开剂就跑到顶了，显得缺顶不完整。
三次换瓶，高度逐步增加
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第三次重新配展开剂时，把溴酚蓝错秤多了五倍。显影过度了。
瓶2也不够高，盖上盖子把纸压弯了。
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第四次瓶的左面那个龙头的里面有水，没有干燥把纸搞湿了。……
图也不像样了
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接受了以上多次失败教训，第五次自己觉得比较规范了，纸在展开剂中浸了六小时四十五分钟，得如下图：
从左至右：苹果：苹果酸标准液，威龙：威龙酒，去年：去年的酒，新酒：刚分离的酒，自然：自然平乳发酵进行了22天的酒，接种：今年经过乳酸菌接种的酒。
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怎样看这个图？医生看X光片一目了然，而我们看X光片则一脸茫然。敬请各位老师帮助分析，在此先行谢过了。
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闲来无事
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忘了，我的测定图是根据AB老师五项测试合并贴中关于层析法苹果酸测定的程序做的。现将该文转贴于下，以便大家检查参考：
一) 层析法测定苹果酸含量:
材料:3升广口瓶, ML溶剂, ML纸, 标准苹果酸溶液.
洗干净手,拿纸边把长方形ML层析纸放在干净的平面上, 沿纸的长边上画一道轻的铅笔线, 离边1.8公分, 在线上做点, 间隔3-4厘米. 左侧第一个点一般用于标准苹果酸. 其他点用于不同的酒样品. 用吸管分别取少量的待测酒样和苹果酸标准溶液.
吸管尖端在铅笔线上迅速分别接触一个湿点, 左侧标准液, 右酒液样品, 湿点直径要相同(即液体量相同以便做对比定量判断), 但不要超过6毫米. 等湿点干了, 原地再点一次, 干了后再来一次. 等都干了, 把纸卷成筒用订书机固定成圆柱体.
在广口瓶里倒入足够的ML展开剂, 能覆盖瓶底约3-4毫米深. 把纸圆柱放进去, 有铅笔线的一端接近瓶底, 盖好盖子.
6小时后(或者更多小时), 直至展开剂的前沿爬到接近纸筒的最上端, 把纸圆柱取出,把纸筒打开, 晾干. 等纸完全干燥后, 层析图可以得出.
问题:
1)ML纸是什么纸, 那里能买到?
回答:好象有专门的层析纸，要是没有使用普通的定性过滤纸也可以，我就是用这样的纸．化学试剂店就有．
2)苹果酸的标准溶液是多大浓度的?
回答: 可以直接在试剂店购买, 也可以自己配. 浓度是模拟葡萄酒中苹果酸的浓度，那么配制0.5%或者1%即可.
葡萄汁中实际的苹果酸在２克左右, 即0.2%． 另外, 这个实验主要是定性判断酒的苹果酸发酵是否完成. 定量判断没有太大的意义, 因为最终不能有苹果酸存在. 但是可以根据其消失的速度, 大致判断发酵结束的时间.
3)ML展开剂需要自己配吗? 展开剂：100ml正丁醇＋0.1g溴酚蓝(溴酚兰是起显影剂)＋50ml乙酸（50％）就可以了，我用它效果还不错，根据层析容器的大小，可按比例调整。
回答: 展开剂都是自己配的，试剂店里这些东西都有．
4)从层析图中怎样判断是否有苹果酸? 怎样知道还有多少苹果酸?
８０％的定性和２０％的定量吧．如果标准液和标准样都点得比较规范，能看出部分的定量效果．乳酸的样点会很大的．酒石酸最底部，苹果酸在中间，乳酸在最上面．或许因为乳酸分子量90, 苹果酸134, 酒石酸150, 估计分子量越大爬的越慢, 因此乳酸就最高了.
和苹果酸标准溶液的爬的印比较一下深浅和粗细, 是否可以大概知道酒里苹果酸的含量.
5)为什么样点要这么小? 由于液体展开剂在扩散时会带动酸往上跑，那些小分子还不在扩散剂里如鱼得水，点的大了还不扩散成一大片了，谁也不认得谁了？所以要小！
另外, 要想使样点一样大, 可以用很细的注射器针头滴一滴, 这个滴很小, 可以使样点在纸上形成的点直径在0.6厘米之内.
6)如果配好乳酸和酒石酸标准溶液的话, 可以用同一种展开剂一起测定酒里的相应成分.
可以大略知道酒里各类酸的情况, 但不是很准确.
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准备点样点
秤取0.1克溴酚蓝的小秤
把龙头卸掉，不再影响显影。
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如果操作程序不错的话，图大概就是这个样子了。试着先拿出一根来分析一下，能否这样来理解呢？
敬请各位老师指教。
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晚上看了几本书，上图所标示的理解又错了。
由于图本身拖尾现象十分严重，所以给分析造成了很大的困难。因此有必要再进行几次制作，方可对图进行有意义的分析。
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8楼的分析应该改为如下图：
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理想的图应该是怎么样的呢？
我想应该如下图：
底色应为紫蓝色，显示点应该为黄色。
现在严重的拖尾现象主要可能是：1，不是专用的层析纸，所用滤纸所固有的缺点；2，样点的浓度可能太高了。
是否是这样呢？还有其他的可能么？请老师们指点。
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又做了几次，包括缩小样点直径至3mm;减少点样次数至4次；都得不到良好效果。换滤纸吧，但淘宝网上找不到专门的层析纸卖，看来只有做滤纸的净化处理了。对于净化处理有两种做法，一种是用盐酸，简单一点但盐酸腐蚀性太强，放弃采用。另一种是用1mol/l的醋酸溶液浸泡数天后用蒸馏水冲洗，再用丙酮加乙醇浸泡一周后晾干。程序虽然多一点，但比较安全。
上午已经将滤纸浸泡于醋酸溶液中了。
溶液挥发性很强，盒上覆盖薄膜。
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跟你学习 呵呵
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滤纸在1摩尔/升的溶液中浸泡3天3夜之后，经蒸馏水淋洗，迫不及待地又进行一次试验。结果如下：
从图上看，拖尾现象有所减轻。
比如苹果酸1的斑点比4楼左1的长条有所缩短，新酒的乳酸斑点A1与苹果酸斑点A2有点分离了，在冰柜里进行了25天自然苹乳发酵的1号瓶的苹果酸斑点B2比新酒的苹果酸斑点A2明显淡化等……
但图中的斑点仍还很不理想，大有点自我安慰的味道。
好在还有下一步：用1：1的丙酮乙醇溶液浸泡至少一周。再接着试。
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10月26日，用新滤纸（该滤纸已在醋酸溶液中浸泡过7天，1：1的丙酮乙酸溶液中浸泡了10天）作了苹果酸测定图；
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由于苹果酸乳酸都没有很好的形成斑点，而是成为一个区间，所以就把它命名为苹果酸区，乳酸区了。这不符合色谱分析的要求，就算是我无奈的“新发明”吧。
从图上或可看出：
新酒是没有经过苹乳发酵的所以它显示的苹果酸黄色色彩较为深些；2号液在冰柜里进行过25天的苹乳发酵，冷冻酒是用乳酸菌接种后在20度室温下进行过5天发酵的，所以苹果酸显示的黄色要淡一些。
仅此而已。
要获得更理想的图和更合理的解释，还有许多原因要找，有许多问题需要解决。
希望得到做过苹果酸测定图的朋友们指教！
希望得到老师们的帮助！
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能看到乳酸的点，最少说明有乳酸了。但酒精发酵时也会产生部分乳酸。如果是新酒的话，做了MLF的可以很好定性的判定MLF的进程。
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谢谢李老师指教，你在哪里发贴呢？我没有见到过标准的做的比较好的层析图，没有比较心里就没底。我的图主要是没有形成较好的斑点，拖尾现象比较严重，虽能看出一点名堂，但不够标准。还有一点可以改正的是我以前在瓶子内侧没有衬一张滤纸，以至于瓶内展开剂气体不够饱和，改正后不知会改善多少？我刚买了本实用色谱法在看，看后争取再做一次。望老师多多关心指教。
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见楼下：
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昨天晚上，我在瓶内衬了一张滤纸，使瓶内展开剂气体饱和。显影6.5小时，得如下图：
标示“去年”的是去年的酒，未经苹乳发酵，但冬天在室外放置了约2月余；去年的最低温度曾到达-3度；
标示“今年”的是今年的酒，经过乳酸菌接种的苹乳发酵，也经过冰柜十天-4至-3度的冷冻；
图中可以看出：去年的酒（未经平如发酵）苹果酸含量很高，而今年经过苹乳的基本上看不到淡黄色的苹果酸了；
底部的酒石酸：去年自然冷冻的比今年冰柜里冷冻的好像明显要少，不知何故？查1234楼的显示图都有同样的结果。看来今年经过冰柜冷冻的酒仍然要放到室外存放两月。
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衬纸的 效果并不明显，与10月25日做的效果差不多；
图中，新酒是指放在冰箱冷藏室里没有参与发酵的4号瓶，他所显示的苹果酸黄色比较明显；
1号瓶进行了自然诱发的苹乳发酵，其苹果酸显示的黄色要比新酒来的淡；
2号瓶经过酒脚接种的，它也进行了苹乳发酵，其苹果酸黄色似乎还淡一些（不很明显）；
“冷冻”是上一次接种进行苹乳发酵后又经冷冻的酒，基本上看不到黄色的苹果酸了。
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滤纸的效果不太理想，能否改用专用层析纸呢？一看价格，吓了一跳：
http://www.zlbj.com.cn/zlbj_Product_3083573.html
一盒20*20厘米的纸400-600元以上（还不大好用，纸高最好25厘米），玩不起，还是用滤纸对付着用吧。
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有一种测定苹果酸的试剂盒，可用于苹果酸的测定，而且效果很好。但这只能适合实验室使用，光是试剂的保存，我们自酿的就做不到。
试剂盒:
MegazymeL-苹果酸含量测定试剂盒可以进行58次/116次的测定试验，并提供有全部的试验方法：
58次测定试剂盒(cat. no. K-LMALR)
瓶1: 双甘氨肽缓冲液 (6 mL, 1.0 M, pH10.0) +L-谷氨酸1 M)+叠氮化钠(0.02 % w/v)
稳定性> 2年，4°C保存。
瓶2: NAD+(380 mg)+ PVP (60 mg)
稳定性> 5年，-20°C保存。
瓶3: 谷草转氨酶(600 U/mL)，悬浮液1.25 mL.
稳定性> 2年，4°C保存。
瓶4: L-苹果酸脱氢酶(1.25 mL, 15,000 U/mL)
稳定性> 2年，4°C保存。
瓶5: L-苹果酸质控标准液(5 mL, 0.15 mg/mL)
稳定性> 2年，4°C保存。
116次测定试剂盒(cat. no. K-LMALL)
瓶1: 双甘氨肽缓冲液 (12 mL, 1.0 M, pH10.0) +L-谷氨酸1 M)+叠氮化钠(0.02 % w/v)
稳定性> 2年，4°C保存。
瓶2: NAD+(380 mg)+ PVP (60 mg)
稳定性> 5年，-20°C保存。
瓶3: 谷草转氨酶(600 U/mL)，悬浮液2.5 mL.
稳定性> 2年，4°C保存。
瓶4: L-苹果酸脱氢酶(2.5 mL, 15,000 U/mL)
稳定性> 2年，4°C保存。
瓶5: L-苹果酸质控标准液(5 mL, 0.15 mg/mL)
稳定性> 2年，4°C保存。
算了吧，还是用滤纸认真做好纸层析图吧！
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我对苹果酸测定图的理解如下，请老师和酿友们指正：（此图与21楼是同一张图，21楼的放大了一倍）
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此图与21、25楼是同一张，只是拍摄时远些小一些了：
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做了几次纸层析苹果酸测定图，觉得有必要小结一下，把其中的一些问题和原因找出来，以便今后改进和其他朋友参考。
在讲问题以前，先把纸层析斑点和怎样看图略述于下：
1）标准的纸层析斑点是怎样的？
2）怎样看层析图：
（色谱分析）
斑点目视比色法：将标准物质配制成多种浓度的系列标样，样品和标准系列标样在同一层析纸上点样、展开、显色。根据组分与标准系列斑点颜色的 深浅 进行目视比色，以两者接近者作为定量依据；也可测量斑点的 面积，近似地求出定量结果。
这种方法是一种半定量法，所得结果有时误差较大（一般为5%--30%）但分析速度较快，常用于最小检出量的测定。实用色谱法第235P
这里讲的是颜色的深浅和斑点的面积来判定标样的含量
苹果酸测定图中的酸的颜色是由黄色来反映的，底色为紫蓝色，黄色的面积（范围）越大，颜色越深，酸的含量越高；反之则反。
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1，用普通的滤纸做层析纸，有可能产生严重的拖尾，第一次做的图滤纸未经酸化处理，苹果酸斑点长达10厘米：
层析纸（滤纸）净化方法：层析纸净化处理方法首先是将层析纸放在1mol/L的醋酸溶液中浸泡数日，然后取出用蒸馏水充分洗涤，这样可以除去纸中无机杂质；再把层析纸放在丙酮和乙醇的混合液（1：1）中浸泡至少1周时间，再取出风干，这样可除去纸中的大部分有机杂质；使用时必须注意把层析纸干燥。（实用色谱法228P）
滤纸经过第一步酸化以后的层析图比未经酸化的有明显进步，苹果酸斑点由10厘米缩短至6厘米以下，经过第二步酸化后，苹果酸斑点缩短至4厘米左右，斑点基本形成：
 
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2，展开剂中溴酚蓝超标；
AB五项合并贴中的展开剂配方是正丁醇100ML，溴酚蓝0.1克，乙酸50ML。此配方所显示的色彩比较柔和，清晰，是经过实践检验的。溴酚蓝超标会使 颜色偏黄，直至焦黄，甚至像火烧过一样，不仅难看，也影响分析判定；
 
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3，层析纸被瓶盖压弯，显示轨迹也弯曲了。（图见2楼）
4，层析纸碰到瓶中龙头或瓶壁，也会影响显示。（图见3楼）
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闲来无事
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5，样点较多，纸的宽度超过玻璃瓶（层析缸）的直径时 ，需要把纸卷成筒状，卷筒时，点样的一面应该朝外，（展开剂展开时外侧“爬痕”比较清晰）我习惯从左至右点样，顺序是：左1为苹果酸，卷反后，苹果酸变成右1去了，图虽一样看，但清晰度要差些了。
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请问，你用的滤纸是几号滤纸啊？还有点样量是多少啊？
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谢谢您啊！我正好在测发酵液中的苹果酸的含，谢谢您的帮助！
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2007-11-17 |
| 头 衔： |
酒客 |
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贴子得分：0
现在业余的比专业还有前途，佩服。不过测数量用层析还是不好用
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桂桂
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| 职 位： |
注册用户 |
| 专家分： |
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| 经验值： |
156 |
| 注 册： |
2010-06-17 |
| 头 衔： |
酒民 |
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贴子得分：0
请问发酵期间必须要测苹果酸吗？在化验室检测 楼主所提供的这种纸层析法也同样可以吗？另外有哪位知道网上的葡萄酒化验操作的相关视频。谢谢！
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拜求葡萄酒化验技能！
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桂桂
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| 职 位： |
注册用户 |
| 专家分： |
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| 经验值： |
156 |
| 注 册： |
2010-06-17 |
| 头 衔： |
酒民 |
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贴子得分：0
楼主太厉害了 佩服。
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三十八度
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| 职 位： |
注册用户 |
| 专家分： |
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| 经验值： |
1821 |
| 注 册： |
2012-06-07 |
| 头 衔： |
酒士 |
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贴子得分：0
社科院院士来着？
收藏了，慢慢学习。
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